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RNA实验操作

qRT-PCR相对定量计算详解

密码子图书馆 2021-09-28 21:14:08RNA实验操作
做完转录组分析之后,一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本的表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法,他的计算方法有很多,常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法,ΔCt法,2^-ΔΔCt法(Livak法),用参照基因的ΔCt

做完转录组分析之后,一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本的表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法,他的计算方法有很多,常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法,ΔCt法,2^-ΔΔCt法(Livak法),用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。这里主要讲解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何计算;

qRT-PCR原理:

以基因的cDNA为模板进行PCR扩增,在PCR扩增过程中,通过收集荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以可以定量。

Ct值是什么意思呢?

Ct 值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。 qRT-PCR在扩增的时候都会有平台期,在平台期之前,PCR 扩增就是简单的指数增长,也就是 1 变 2,2 变 4,4 变 8 …扩增。数学形式就是 2 的 ct 次方,到了平台期所有基因扩增的数目是一致的,而唯一有区别的则是 ct 值的不同。所以不难推断出 ct 值越小,反应扩增到达平台期所需循环数越少,目的基因起始含量越高。这里可以得到公式:

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计算-ΔΔCt

在这里,我们有一个对照组,一个处理组,还有一个内参基因和目的基因,想看一下目的基因在处理组中相对与对照中的表达差异,也就是计算-ΔΔCt:数据如下:

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1.计算每组内参基因sgAction Ct均值

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  1. 计算第一个 Δct,即每组的待检目的基因减去内参基因的 Ct 值

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3.计算对照CK组中 Δct 的均值,再用处理组的 每一个Δct 减去刚刚计算的对照CK组的 Δct 均值,得到 ΔΔct(红框框)

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4.相对表达量计算,也就是相对于对照组: 2^-ΔΔct:

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不难看出这里的-ΔΔct和我们转录组当中的log2(fold change)值是一致的,所以如果多做几个基因就可以绘制类似如下图:

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或者相关性点图:

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好了,今天就先介绍到这里。
文章来源:微信公众号组学大讲堂