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蛋白质实验操作

蛋白质稳定性的保持

密码子图书馆 2021-09-13 13:50:37蛋白质实验操作
本篇内容为阅读《蛋白质纯化指南》(第二版)(陈薇主译) "第10章 蛋白质稳定性的保持"所作的读书笔记。【摘要】纯化过程中需要非常谨慎地保持目标蛋白质的完整和充足的活性。本章重点阐述在纯化和储存过程中保持蛋白质稳定所要牢记的重点。
本篇内容为阅读《蛋白质纯化指南》(第二版)(陈薇主译) "第10章 蛋白质稳定性的保持"所作的读书笔记。

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【摘要】

纯化过程中需要非常谨慎地保持目标蛋白质的完整和充足的活性。本章重点阐述在纯化和储存过程中保持蛋白质稳定所要牢记的重点。

【蛋白质失活的原因】

在各种条件下使用不同操作方法从细胞环境中提取蛋白质将会导致其失活和结构改变。这些操作包括稀释、改变溶液条件,暴露于各种降解酶、氧气、重金属及各种材料的表面,以及生理条件的变化(如冻融作用)等

【常规处理方法】

要保持蛋白质的稳定,应避免可以使其变性的处理方法。
  • 不要剧烈搅拌或涡旋,因为可能导致蛋白质氧化或表面变性;

  • 蛋白质溶液不应暴露于极端pH、高温、有机溶剂或其他可能促使其变性的条件;

  • 解冻状态下长期储存蛋白质溶液,细菌和真菌的生长将会是一个问题;

  • 最好使用蒸馏水配制将与蛋白质接触的所有溶液,并要将蒸馏水储存在无藻类生长的容器中。

【浓缩和溶剂条件】

从细胞中提取蛋白质不可避免会改变其环境,蛋白在体内的环境一般是稳定的。即高蛋白浓度(>1 mg/mL)、接近中性的pH、适中的离子强度、还原态等。

实际纯化时有些条件与此稳定性条件一致,有些则不一致。在纯化过程中将浓缩与稀释蛋白质的步骤交替进行可避免蛋白被不断稀释,能有助于维持蛋白稳定性。

溶液条件也极其重要。

  • 避免不必要的pH变化的缓冲体系。

  • 尤其要注意缓冲液的阴离子,因为很多情况下Cl-可能是有害的

  • EDTA:0.1 mM的浓度添加,用于螯合可能与蛋白质相互作用或促进氧化的重金属离子。

  • 还原剂:通常用于对抗氧化作用,尤其是半胱氨酸残基的氧化。可优先使用0.1~1 mM的DTT。

  • 盐:某些情况下,加入盐以保持一定的离子强度。

  • 甘油:5~20%的甘油往往有助于保持稳定,并且适用于大多数纯化步骤。

  • 去污剂:有时需要加入低水平的去污剂以防止蛋白质聚集或吸附到所使用器材(如玻璃器皿)的表面。

  • 蛋白酶抑制剂:在纯化的早期尤其有用。

【稳定性实验和储存条件】

在一种新蛋白质的纯化过程中,最重要的研究之一是稳定性和存储研究。意味着在纯化过程的每个步骤之后,一定要检测目标蛋白的稳定性和存储性。

短期稳定性:最简单的测试办法是取少量蛋白质溶液,将它们储存在不同的条件下(不同温度、加与不加稳定剂),然后在不同的时间段检测蛋白质的活性。另外需要知道下一步纯化步骤是什么。有些存储条件对稳定性很好,但不利于下一步的纯化。
长期稳定性:当完成了纯化并准备长期储存所纯化的蛋白质时,需要关注蛋白的长期稳定性。此时,很多纯化过程中不适用的条件变得可用,包括高浓度的甘油、稳定性添加剂、甚至其他蛋白质(如人血白蛋白)。储存条件的选择取决于什么对蛋白质稳定性有效、以及纯化的蛋白质的用途。
冻融稳定性:蛋白质存储的相关问题还有纯化蛋白质溶液的冻融。避免反复冻融的一种方式是将纯化的蛋白质分装成小份,每次按需取出其中的一份或几份融解。如果需要反复冻融,最好是使用快速的冻融程序。解冻的溶液应该轻轻地混匀

【蛋白质水解和蛋白酶抑制剂】

蛋白质水解是蛋白质纯化的一个主要问题,可能导致进行蛋白质大小和结构分析时得出错误的结论。蛋白质水解可能出现在纯化过程的任何阶段。因为纯化过程总是趋向于消除这些具有水解活性的污染物,所以一般总的水解活性在初始的粗提物中是最高的。

如何判断特定情况下的蛋白质水解?最简单的测试方法是将提取物或部分纯化的蛋白质在温和的温度(如30°C)下孵育,分时间段取出部分样品进行生物活性分析。如果活性丧失,建议添加蛋白酶抑制剂。

细胞中含有多种不同的酶类,常用的蛋白酶抑制剂如下表所示。

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请注意,蛋白酶抑制剂在一定条件下是有毒的和/或不稳定的。在没有研究清楚它们的性质之前请不要使用。

【蛋白质活性丢失】

蛋白质活性丢失时,应仔细计算酶单位,以评估活力损失的程度。对于许多纯化步骤,损失高达50%是正常的。

如果某一纯化步骤蛋白质活性完全丧失,则应考虑其他可能性:

1)可能某些情况下,蛋白质与层析柱结合得非常紧密,需要使用极端洗脱条件。可能需要增加离子强度、使用一个离液序列比较高的盐,或在洗脱液中加入去污剂或乙二醇。
2)蛋白质的活性发挥需要多个组分,其在分级分离过程中去除了。可将前一步骤的组分混合到一起,检测其活性。

有时在纯化步骤之间蛋白质可能会失活,如在透析或浓缩过程中,甚至储存过程中。可能是蛋白质吸附在透析管或浓缩膜上了。

少量纯化(低于mg级蛋白质量的纯化)操作时要注意一系列特殊问题:

  • 蛋白质因吸附于各种表面而损失的可能性,由于蛋白量少,吸附损失的蛋白质量占比可能很大。

  • 应该避免使用聚苯乙烯材料制成的容器,因为它具有较高的蛋白质结合能力。

  • 仔细冲洗管道以确保最大蛋白回收率。

  • 低浓度非离子型去污剂可能有助于防止蛋白质于表面结合。

  • 计算蛋白质质量平衡,可提醒研究者哪些步骤发生了不必要的蛋白质损失。

【书籍简介】

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作者:
(美)R.R. 伯吉斯,(美)M.P. 多伊彻编著;陈薇主译
ISBN:
9787030380951
出版日期:
2013-07
版次:
1
中图分类号:
Q510.3

本书对蛋白质纯化相关的技术、材料、试剂、设备等进行了介绍。全书12部分44章,包括建立蛋白质纯化程序,常用技术,重组蛋白质的表达纯化,提取物和亚细胞组分的分离,详细纯化步骤(批量法、层析法、亲和法、电泳法),膜蛋白和糖蛋白的纯化,纯化蛋白质的特性等内容。
文章来源:微信公众号下游工艺文献分享荟