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蛋白质实验操作

蛋白质浓缩和溶质的去除

密码子图书馆 2021-09-13 13:48:45蛋白质实验操作
本篇内容为阅读《蛋白质纯化指南》(第二版)(陈薇主译) "第9章 蛋白质浓缩和溶质的去除"所作的读书笔记。【摘要】现有多种用于去除溶剂的方法,包括冻干、反向萃取、溶质析出、透析、超滤和层析技术。小型化和高通量的蛋白质分析取得了极大
本篇内容为阅读《蛋白质纯化指南》(第二版)(陈薇主译) "第9章 蛋白质浓缩和溶质的去除"所作的读书笔记。

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【摘要】

现有多种用于去除溶剂的方法,包括冻干、反向萃取、溶质析出、透析、超滤和层析技术。小型化和高通量的蛋白质分析取得了极大的进步,为小规模样品制备,包括分析前样品的浓缩和脱盐等操作提供了多种多样的组合模式。

【层析】

凝胶过滤:广泛应用于非变性条件下的蛋白质脱盐。大分子蛋白质不会进入填料的小孔中,从而在流动过程中脱盐。通常填料体积是样品体积的4~20倍柱长与柱径比为5~10时,层析柱的分辨率最佳。缺点是在层析过程中蛋白样品被稀释。
离子交换层析:离子交换填料可以捕获小分子阴离子或阳离子,最小限度地截留高分子质量的蛋白质分子。可通过批处理模式或填充床实现脱盐。缺点是可能引起蛋白质酸化、沉淀和样品稀释。
反相层析:是分离、脱盐和浓缩蛋白质的一项流行技术。微型离心柱、毛细管、微量加样器吸头和微孔板,用于对样品量低至飞摩尔级的蛋白质进行快速脱盐。通常使用脂肪族的C4、C8、C12和C18化合物。
疏水和亲和层析:除了上述几种层析,其他可用的材料包括疏水、亲水、金属螯合、蛋白质亲和填料。
  • 亲水性填料的潜在缺点是蛋白质常常以变性的形式回收。

  • 固定化金属螯合层析(IMAC)吸附剂,以及含有TiO2的填料已被选择性用于质谱分析前对磷肽类进行浓缩和脱盐。

  • 使用高效液相色谱(HPLC)技术为质谱MS分析准备蛋白质样品的常规操作。

生产规模的层析:制备规模和生产规模的蛋白质回收往往包括浓缩和脱盐。柱层析仍然是蛋白质纯化的核心技术,归因于其高选择性、方便耐用的填充填料、原料在填料中通过流动而进行传送。

【电泳

通过凝胶电泳进行蛋白质浓缩通常用于其后的分析技术中,用以增强灵敏度。例如毛细管电泳法可通过堆积作用实现蛋白质浓缩。

【透析】

透析是基于分子量大小的液相分离技术,通过半透膜的选择性扩散实现脱盐或换液。通常透析液的体积要比蛋白质样品的体积大若干个数量级。

影响透析产品稳定回收的几个因素:

  • 缓冲液交换所需的时间

  • 透析系统的设计

  • 透析膜的化学和形态学特征

【超滤】

超滤UF所利用的分离机制本质上相当于透析。超滤与透析的区别在于:应用、操作模式和膜的结构不同。

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用于超滤的膜的生产技术在过去几十年里都没有改变。然而,在膜孔径分布、膜形态和膜修饰等方面的控制技术已有显著改变。

超滤膜的3个主要铸造技术分别是空气铸造、浸渍铸造和融化铸造。他们的区别主要在于去溶剂化的方法和设备上。

纤维素聚合物具有低蛋白结合的优点,但是暴露于碱性次氯酸盐清洁液时一般会降解

新型纤维素复合膜(如Millipore的Ultracel)具有低污染和低蛋白质结合的能力,机械强度极高,可耐受极端操作条件

聚砜(PS)和聚醚砜(PES)高分子膜具有充分的抗碱能力,可以应用于需要用NaOH清洗的情况,但更容易被生物制品溶液污染。

表面修饰已经成为用于减少膜污染的最通用的方法。

超滤装置:
  • 绝大部分小规模超滤膜设备设计成盲端操作的模式,而大规模的超滤系统采用切向流操作模式。

  • 盲端设备:如真空过滤装置、针头式滤器、离心式过滤器、多孔滤板

渗滤:使用超滤进行缓冲液交换的过程。

【冷冻干燥】

溶液中溶质的浓缩从热力学上通过驱使溶剂变成气态进入顶部空间(蒸发)或煮沸而实现。通过增加溶液的温度或者降低大气压(例如真空)都可以使溶剂沸腾,后者被称为真空浓缩。冷冻干燥过程中,样品的温度比溶液的凝固点低,溶剂通过升华而被去除。冷冻和真空可同时进行,热量和顶部的空气被除去,目标产品被浓缩。

冷冻干燥一般分为3个步骤:

1)冷冻:冷冻速率会影响最终产品的质量。例如,慢冻会导致大冰晶形成,会加快冷冻干燥的速率,但可能会使不稳定的蛋白质变性。相反,速冻会形成小冰晶,使冷冻干燥速率降低,但却能保护蛋白质的稳定性
2)初级干燥:通过升华作用,大于80%的溶剂从固态直接变为气态。残留的溶剂以湿气的形式仍然吸附在产品上。干燥速率会影响冻干“蛋糕”的结构和形态。
3)二次干燥:溶剂残留的吸附降低到足以抑制微生物生长或化学反应发生的潮湿水平,同时保持了动感产品的活性和完整性。产品的物理性质决定了二次干燥的可持续时间。例如,蛋白质通常需要残留水分的存在以维持结构的完整性和生物活性。必要残余水分的量因产品而异,须凭经验而定。

冷冻干燥过程中最困难的挑战之一是现特定产品的目标水含量

【沉淀】

沉淀是一种常用的纯化技术,用于蛋白质的浓缩和脱盐。是通过加入某种试剂改变蛋白质的溶解度,从而将蛋白质从一种溶液中以固体的形式分离的过程。

沉淀反应可通过加入中性盐(如硫酸铵)、有机溶剂(乙醇、丙酮、氯仿/甲醇、TCA等)、非离子型亲水聚合物(如聚乙二醇)、多价金属离子等来诱导,或通过加入酸或碱来进行等电点沉淀。

影响蛋白质溶解度最重要的因素是:结构、大小、电荷和溶剂

许多沉淀方法,包括有机溶剂和等电点沉淀,可能会导致蛋白质变性或生物活性降低。但是一些分析技术通常采用变性的蛋白质,例如SDS-PAGE,对这些分析方法,可将蛋白质变性的沉淀方法仍然适用。

【结晶】

结晶是一种在水溶液中受控制的沉淀。主要有4个变量可用来控制结晶的形态和回收。

1)蛋白质的浓度
2)沉淀剂的浓度
3)pH
4)温度

结晶类似于沉淀,都是从溶液中形成固体颗粒;但沉淀具有不确定的形态,呈现出小颗粒特征,而结晶是高度有序的,通常呈现出较大的颗粒。

实际上,对一个蛋白质结晶比对其沉淀往往更加困难,为了进行蛋白质浓缩和脱盐,往往更常用沉淀的方法

【书籍简介】

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作者:
(美)R.R. 伯吉斯,(美)M.P. 多伊彻编著;陈薇主译
ISBN:
9787030380951
出版日期:
2013-07
版次:
1
中图分类号:
Q510.3

本书对蛋白质纯化相关的技术、材料、试剂、设备等进行了介绍。全书12部分44章,包括建立蛋白质纯化程序,常用技术,重组蛋白质的表达纯化,提取物和亚细胞组分的分离,详细纯化步骤(批量法、层析法、亲和法、电泳法),膜蛋白和糖蛋白的纯化,纯化蛋白质的特性等内容。
文章来源:微信公众号下游工艺文献分享荟