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RNA实验操作

Hortic Res | 逐步优化实时 RT-PCR 分析的优化方案

密码子图书馆 2021-09-13 13:34:35RNA实验操作
查看原文   查看PDF『点击免费订阅《园艺研究》电子刊』实时荧光定量PCR(qPCR)是一种重要的分析基因表达水平的方法。该方法的准确性依赖于引物的特异性、扩增条件的优化和内参基因的稳定性。目前,引物设计主要考虑的是引物靶向特异性、引物GC含量、引

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实时荧光定量PCR(qPCR)是一种重要的分析基因表达水平的方法。该方法的准确性依赖于引物的特异性、扩增条件的优化和内参基因的稳定性。目前,引物设计主要考虑的是引物靶向特异性、引物GC含量、引物二聚体和二级结构的形成。基于qPCR引物设计而开发的在线辅助设计工具无法有效去除植物基因组中同源基因序列之间的相似性带来的引物设计偏差,导致研究者高估所设计引物的质量而跳过qPCR参数的优化步骤。然而,qPCR参数的优化对每个基因引物的效率、特异性和敏感性都起着至关重要的作用。不良的qPCR反应,会导致研究者对实验结果的错误解释或实验结果的不可重复。


近日,Horticulture Research 在线发表了题为An optimized protocol for stepwise optimization of real-time RT-PCR analysis 的研究论文。该研究提出了一个易于操作的、系统的、全面优化的qPCR分析方案,并作为案例研究将其应用于观赏和能源植物沙生蔗茅(Tripidium ravennae)和大豆在不同生物或非生物胁迫实验条件下的最优内参基因的鉴定。


该研究中,研究者建立了一套集引物序列设计优化、qPCR扩增条件(引物退火温度、引物浓度和最佳模板cDNA浓度范围)逐步优化、和将效率校准和标准曲线方法与2−ΔΔCt方法相结合的系统全面的qPCR优化分析方案:


(1)该方法从设计特异性序列引物开始,从公共全基因组序列数据库下载获得植物基因组中每个参考基因或感兴趣的目标基因的全部同源序列(如果一个植物物种的全基因组序列尚未公开,则可以利用转录组学数据或cDNA末端快速扩增(RACE)技术从相关植物基因组中获得每个基因的所有同源序列的cDNA序列)。然后对每个基因的这些同源序列进行蛋白序列和cDNA序列比对,再根据蛋白质序列比对进行cDNA序列比对的手动微调。


(2)基于cDNA序列比对中的SNPs为每个基因设计了两对正向引物、两对反向引物,共组成四对特异性引物。要求每个引物3’端的最后一个碱基是基因序列特异性的SNP,每个引物最后一个碱基之前的碱基如果也有基因序列特异性的SNPs更好 (见Suppl.Fig. 27)


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Fig. S27 Alignment of partial cDNA sequences of the soybean cons4 (Glyma.12G020500) gene and its homologous sequences in soybean for qPCR primer design. 


(3)引物特异性通过qPCR, Sanger测序和融解曲线验证。


(4)对于qPCR条件的逐级优化:


a. 研究者首先对引物退火温度进行了优化:用1:10 稀释的叶片cDNA作为模板和350 mM 引物反应浓度(需要Ct值位于15 -32 之间)作为反应条件, 作者对每个基因的每对引物测试了不同的引物退火温度,确定了每对引物的最佳退火温度,即最低Ct值时的引物退火温度。


b. 用1:10 稀释的叶片cDNA作为模板和每对引物的最佳退火温度(需要Ct值位于15 -32 之间), 作者对每个基因的每对引物测试了不同的引物反应浓度,确定了每对引物的最佳引物反应浓度,即最低Ct值时的引物反应浓度。


c. 用每对引物的最佳退火温度和最佳引物反应浓度(需要Ct值位于15 -32 之间)作者对每个基因的每对引物测试了cDNA模板连续稀释(serial dilution)的浓度梯度,确定了每个基因的最佳cDNA模板浓度范围,得到了每个基因的每对引物的cDNA浓度对数和相应的Ct值之间的标准曲线(Fig. 1)

当设计的基因的最优引物对(primer pair)满足R2 ≥ 0.9999,效率 (E) = 100 ± 5% 时,就可以利用2−ΔΔCt方法对基因进行相对定量表达数据的分析。


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Fig. 1 The plot of the averaged Ct values from three technical replicates against the Log (cDNA in ng/reaction) for optimizing qPCR conditions for the best primer pair of each of the eight candidate reference genes in T. ravennae


作为案例研究,研究者利用该方法对沙生蔗茅(T. ravennae)的不同组织和不同花序发育阶段的最佳内参基因进行了鉴定,并验证了其在不同非生物胁迫(Figs. 3; 4)条件下的有效性。结果表明8个基因中BI1TCTPHEF1αAldolaseUbi4AldolaseUbi4Aldolase分别在不同组织中、不同的花序发育阶段、盐胁迫条件下、和干旱胁迫条件下最稳定;而H3.3AH在这些实验条件下的表达都不稳定,所以不适合作为参考基因(Figs. 6; 7)


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Fig. 3 Representative images of the phenotype, fold change in fresh biomass weight, and transcript abundance of the eight candidate reference genes measured by qPCR in the leaves of T. ravennae seedlings under salinity stress. 


此外,该研究还应用该方法检测了大豆内参基因在Xanthomonas axonopodis pv glycine(Xag)生物胁迫下的表达稳定性(Fig. 8)在对抗性品种W82和感性品种Jack接种后的0、12、24、48、72和120 hpt的时间点,6个候选内参基因中,con6con4的表达最为稳定,而Tubulin的稳定性最差。所以,该研究建议使用con6con4作为一对内参基因来进行大豆细菌性斑疹病病害研究。


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Fig. 8. Disease symptoms(A) and transcript abundance (B) of the six candidate reference genes in the leaves of soybean cvs. W82 (Xag-resistant) and Jack (Xag-susceptible) under Xag strain EB08 treatment.


因此,以上研究均证明了这一优化的qPCR方法的高效性和广泛的适用性。在文章结尾,作者还总结了该方法的路线图(Fig. 9)


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Fig. 9. Guideline for performing qPCR analysis in the present study. 


南京农业大学/北卡州立大学联培博士研究生赵方洲为该论文第一作者,北卡罗莱纳州立大学刘武生助理教授为该论文通讯作者。该研究得到了美国农业部国家食品和农业研究所(NIFA) 的孵化项目(No. 02685)、北卡罗莱纳州立大学的启动资金等的资助。



文章链接:
https://www.nature.com/articles/s41438-021-00616-w

文章来源:微信公众号园艺研究