登录  注册 退出

密码子图书馆

您现在的位置是: 首页 > 实验技能 > DNA实验操作

DNA实验操作

质粒构建及细胞转染技术

密码子图书馆 2021-09-12 22:50:59DNA实验操作
转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水

   转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。


实验原理:

   外源基因进入细胞主要有四种方法:电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系,一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题,通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。下图所示为脂质体介导的外源质粒进入细胞的转染示意图。

 

图片


具体步骤:

1.质粒构建:引物设计:选择合适的载体,酶切位点及其顺序(酶切位点的顺序一般不能颠倒)。在NCBIPUBMED上再次确认目的片段的碱基序列,并送生物公司合成,对公司合成的引物离心,10000rpm, 4 5-10分钟,在超净台按照管子上标注的体积加入去离子水,再把上游引物和下游已加物混在一起。


2.   PCR(P处目的片段)

1)摇菌过夜: TIANGEN大肠杆菌2ul及3mlLB加入15ml离心管中根据实验所需条件加入相应的抗生素。

2)PCR:

图片


退火温度根据Tm值计算,一般小于Tm2℃。

3)跑胶回收:

图片

一般25分钟后即可点样跑胶,130-150V25-30min。紫外灯下观察,切胶(

防护手套及口罩)。

4)做胶回收(TaKaRa公司DNA纯化回收试剂盒):根据试剂盒的protocol来源,在胶回收的最后一步,Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴,并在加过EB后,放在37℃温箱中2min。对胶回收的产物验证,可建立10μl体系:回收产物2μl10×loadingbuffer 2μl、去离子水6μl

5)酶切及链接:目的片段酶切:(37℃酶切过夜或者4小时以上)

图片


载体酶切:37℃酶切过夜或者4小时以上)

图片

为方便以后使用,载体可一次多切一些。酶切时,首先要核对一下酶的buffer,有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer,那么就要先切一端,酶切回收后再用另一种酶切另一端,然后再酶切产物回收。

图片


6)转化:

图片


冰上20分钟→热激:42 90S→冰上2min,1mlSOC(或者1mlLB37 180rpm45min),将上述转后的菌加入到100mlLB中,在按抗生素:LB=1:1000的比例加入抗生素(100mlLB2Kx的氨苄)250rpm过夜。

7)收菌:取过夜菌置50ml离心管,4℃离心6000g3-5min,重复一次后美观共收集100ml过夜菌沉淀(倒置在草纸上使液体流尽)。每管加入8mlRES-EF(RnaseA),重悬细菌沉淀。每管加入等量的LYS-EF buffer,轻轻上下颠倒离心管4-6次,室温放置5min,使细菌完全裂解,溶液透明,无团块或絮状物。

8)平衡及洗脱:滤芯插入柱子,将柱子架于50ml离心管上,取15mlEQU-EF buffer 沿滤芯四周加入。在等待EQU-EF buffer滤完时,往裂解好的菌液中加入8mlNEU-EFbuffer,颠倒混匀。冰上孵育5min 10000rpm 4℃离心5-10min,将上清吸入到平衡好的滤芯中,重力自流尽。过滤完毕后,吸取5mlFIL-EF buffer.沿滤芯四周加入,过滤完后将滤芯去掉,往滤柱中加入35mlENDO-EF buffer(去内毒素),待滤完后再加入15ml washi-EF buffer过滤。取一支干净的15ml超速离心管,将滤完的柱子插入离心管中,用高压条将二者绑好,往滤柱中加入5ml Elu-EF buffer

9)沉淀、洗涤:待Elu-EF buffer滤完后,弃滤柱,往离心管中加入5ml的异丙醇(将质粒沉淀下来),混匀,静止10min-10000rpm, 4 30min, 弃上清。加入5ml70%究竟或用15ml三蒸水+35ml无水乙醇配制,混匀后离心,10000rpm 10min 常温。弃上清,重复上述步骤一次,弃上清,把上清吸尽,再空离一次,把液体吸尽后吹干。取100-300μl高压过的溶解质粒,定量后,将质粒的浓度调制1μg/μl, -20℃保存。


3.细胞转染:

  本实验室常用invitrogen的细胞转染试剂:Lipofectamine2000转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞,使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEM培养基)稀释0.8μg-1.0μg DNA对于每孔细胞,使用50μl OPTI-MEM培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。)混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine 2000(第3步)。在室温保温20分钟。 注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5ml无血清培养基。在375%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

注意事项:

1.     健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性:通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。

2.     通过合适的阳性对照优化转染和检测条件:对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。或用空载质粒转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

3.     即使Lipofectamine2000使用OPTI-MEM稀释,细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEMLipofectamine2000的稀释液,必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

4.     如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。
文章来源:微信公众号生信菜鸟团