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蛋白相对定量技术介绍

密码子图书馆 2021-10-05 10:46:21生物百科
在蛋白质组学研究领域,基于液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术可在生物样本中检测和相对定量上千个蛋白,目前已被广泛应用,并且发展出了标记定量(iTRAQ/TMT、SILAC)和非标记定量(Label free)两种主流方法,这些方法都是基于数据

在蛋白质组学研究领域,基于液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术可在生物样本中检测和相对定量上千个蛋白,目前已被广泛应用,并且发展出了标记定量(iTRAQ/TMT、SILAC)和非标记定量(Label free)两种主流方法,这些方法都是基于数据依赖性采集模式(data-dependent acquisition, DDA)来采集蛋白质谱数据的,该方法也称为“鸟枪法(shotgun)。随着DDA技术的不断发展、完善,近几年出现的DIA技术(data-independent acquisition,数据非依赖性采集)具有高通量又定量精准、重复性高的特点。

上期蛋白质组专题中为大家介绍了标记定量(iTRAQ/TMT)技术的相关知识,今天一起来学习非标记定量(Label free)、SILAC、DIA技术相关知识。

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1
Label-free技术

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蛋白质非标记定量技术(label-free)是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准,只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,比较不同样品中相应肽段的信号强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

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蛋白组学文章数统计(pubmed)

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从图中可以看出,近十几年Label-free的文章数是iTRAQ及TMT的7倍。


文章发表杂志情况统计

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Label-free与iTRAQ的选择

以下情况可优先选择iTRAQ:

①实验组数低于8组(即同时比较的样本数≤8);

②样本背景极为相似(相同物种和相同的样本类型);

③经费有限,需要通过高性价比方案完成研究。

更适合选择Label free的情况:

①实验组数高于10组;

②不同物种、不同来源或部位的样本,需要同时进行蛋白组分析和定量;

③需要区分样本中的“有无蛋白”;

④追求更精准的定性定量效果,避免标记和液相分组引入的实验误差;

⑤需要对采集的数据进行多次分析。


2
SILAC技术

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SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture,SILAC)。其原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸,细胞经5-6代倍增周期后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白质按细胞数或蛋白量等比例混合,经分离、纯化后进行质谱鉴定。


3
DIA技术

采用数据非依赖性采集模式DIA通过LC-MS/MS对蛋白质肽段进行质谱分析,结合传统数据依赖性采集模式DDA(如iTRAQ、TMT等)构建的谱图库,可对大样本量(≥10)的蛋白组进行鉴定、定量并获得蛋白表达量的变化。相较于传统的 DDA 定量,DIA 定量方法具有重现性好、受干扰小、定量准确等优点。鉴于 DIA 定量二级谱图的复杂性,需要先采用 DDA 方式构建一个谱图库。

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DIA技术优势

相比传统的DDA方式,DIA具有以下的优势:

① 鉴定数高:鉴定数量提高30%,一次可鉴定7000+;

② 重复性好:技术重复可到90%;

③ 定量准确度好。


今天的内容分享完啦,大家记得收藏好慢慢学习哦~
文章来源:微信公众联川生物